Au mois de mars 1886, il entre à l'Académie Julian, où il a pour professeur Tony Robert-Fleury. En juin 1887, à sa troisième tentative, il est admis à l'École des beaux-arts de Paris. L'année suivante, pendant six semaines, il a pour professeur Jean-Léon Gérôme. Pendant ses études, Vuillard s'intéresse aux natures mortes réalistes et aux intérieurs domestiques. Les artistes allemands du xviie siècle l'intéressent particulièrement.
Plus tard, Vuillard peint aussi de grands panneaux décoratifs représentant des paysages.
En 1889, Maurice Denis le convainc de se joindre à un petit groupe dissident de l'Académie Julian, qui réalise des œuvres empreintes de symbolisme et de spiritualité, et qui s'autoproclame « confrérie des nabis ». Paul Sérusier développe dans le groupe nabi un amour de la méthode synthétiste, qui repose sur la mémoire et l'imagination plus que sur l'observation directe. Vuillard, d'abord réticent à l'idée que le peintre ne cherche pas à reproduire de façon réaliste ce qu'il voit, finit, vers 1890, par s'essayer à ses premières œuvres synthétistes.
Jos Hessel est son marchand exclusif et son mécène dont l'épouse, Lucy, est son modèle favori, mais aussi sa maîtresse pendant de nombreuses années ; il la représente dans L'Allée en 1907. Dans l'entre-deux-guerres, le peintre séjourne souvent chez eux au château des Clayes (Yvelines). Le château et son parc lui furent une source d'inspiration pour de nombreuses œuvres. (Sous-bois au printemps au château des Clayes, Le Parc du château des Clayes, etc.). Une place de la commune porte depuis son nom.
Pierre Bonnard en 1910 ébaucha son portrait de profil qui était conservé dans une collection Mellon en 1966, ainsi qu'un autoportrait de 1891.
Vuillard a représenté de nombreuses scènes d'intérieurs, notamment avec sa mère jusqu'à la mort de cette dernière en 1928. La douce atmosphère de ces scènes de la vie quotidienne, dont il fait un sujet de prédilection, le qualifient comme artiste « intimiste ». Il a cependant contesté trouver le plus d'inspiration dans ces « lieux familiers ». « Vuillard ne faisait jamais poser ses modèles, il les surprenait chez eux, dans le décor qui leur était familier. Sa mère remplissait une carafe, K. X. Roussel lisait un journal, la chanteuse était à son piano, l'homme d'affaires à sa table, les enfants à leurs jeux, et le peintre leur disait : « Ne bougez plus, restez comme ça ! ». Il faisait alors un croquis et, dans cette première vision, on pouvait retrouver tout le tableau. Certaines de ses œuvres exigeront des mois, voire des années de travail, mais une fois achevées elle conserveront la fraîcheur de la première vision » (Antoine Salomon).
Il est élu membre de l'Académie des beaux-arts en 1938. Début juin 1940, il tombe malade.
Ses amis Lucy et Jos Hessel, qui avaient décidé de quitter la capitale devant l'avancée des troupes allemandes, ne veulent pas le laisser seul à Paris et le transportent à La Baule où il meurt quelques semaines plus tard au Castel Marie-Louise. Il est inhumé à Paris, au cimetière des Batignolles (26e division).